SN/T 1201-2014 英語 PDF (SNT1201-2014)

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SN/T 1201-2014: 飼料中の遺伝子組み換え植物成分の検出のためのPCRプロトコル
シリアル番号 1201-2014
出入国検査および検疫産業
中華人民共和国の標準
SN/T 1201-2003 の置き換え
遺伝子組み換え植物の検出のためのPCRプロトコル
飼料の成分
発行日: 2014年11月19日
実施日: 2015 年 5 月 1 日
発行元：国家品質監督検査総局
中国の検疫
目次
序文…3
1 範囲 ... 4
2 規範的参照 ... 4
3 用語、定義、略語...4
4 原則 ... 7
5 主な装置と試薬 ... 7
6 汚染防止対策 ... 13
7 サンプリングとサンプルの準備 ... 13
8 検査手順 ... 13
9 結果の判定と発表 ... 16
10 サンプルの保管 ... 17
遺伝子組み換え植物の検出のためのPCRプロトコル
飼料の成分
1 範囲
この規格は、定性的なリアルタイム蛍光PCR検出法を規定しており、
飼料中の遺伝子組み換え植物成分。
この規格は、遺伝子組み換え植物の定性的な検出に適用される。
大豆、トウモロコシ、米、菜種、綿花、アルファルファ、飼料用小麦などの成分、
関連する行の識別。
この基準は、遺伝子組み換え作物の定性的な検出にも適用されます。
蒸留乾燥穀物の成分と可溶性物質、および関連する物質の同定
行。
2 規範的参照
この文書の申請には以下の文書が必須です。
文書の場合、指定された日付のバージョンのみがこの文書に適用されます。
日付のない文書については、最新版（すべての修正を含む）のみが適用されます。
この規格に適用可能です。
GB/T 6682 分析実験室用水 - 仕様と試験方法
GB/T 19495.2 遺伝子組み換え生物および派生製品の検出 -
研究室の一般的な要件
GB/T 19495.7 遺伝子組み換え生物および派生製品の検出 -
サンプリングとサンプル準備の方法
3 用語、定義、略語
3.1 用語と定義
この文書には以下の用語と定義が適用されます。
3.1.1
餌
全ての人間が飼育する動物の食料の総称。
飼料は、狭義には、主に、
農業または畜産。
3.1.2
リアルタイム蛍光ポリメラーゼ連鎖反応
ポリメラーゼ連鎖反応システムに蛍光基が追加され、
PCRプロセスは蛍光信号の蓄積によってリアルタイムで監視され、
蛍光シグナルの強度はテンプレートの数を直接反映します。
3.2 略語
この文書では以下の略語が適用されます。
Acp1: 酸性ホスファターゼ1
BAR: ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子
BnACCg8: アセチルCoAカルボキシラーゼ遺伝子
bp: 塩基対
Btc: 遺伝子組み換えイネTT51-1とBt shanyouの構造特異的DNA配列
63
CaMV35S: カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター
CP4-EPSPS: 5-エノールピルビルシキミ酸-3-リン酸合成酵素遺伝子
CryIA(b): Bacillus thuringiensis subsp.のcryIA (b)遺伝子[合成遺伝子
最初の648アミノ酸をコードし、殺虫活性切断産物は
バチルス・チューリンゲンシス亜種クルスタキ・スチームHD-1のcryIA（b）遺伝子のそれ]
CryIA(c): Bacillus thuringiensisのcryIA (c)遺伝子[合成遺伝子でコードされている
29〜613アミノ酸の殺虫活性切断産物は、
バチルス・チューリンゲンシスのcryIA（c）遺伝子]
CryIA (b) /CryIA(c): バチルス・チューリンゲンシス殺虫性タンパク質cryIAの融合遺伝子
(b) および cryIA (c)
Ct値: 各反応チューブ内の蛍光シグナルが
設定されたしきい値（サイクルしきい値）に達すると通過する
CTAB: セチルトリチルアンモニウム臭化物
dATP: デオキシアデノシン三リン酸
4つの原則
リアルタイム蛍光定量PCR技術とは、
PCR反応システムに蛍光基を導入し、蛍光基の蓄積を利用して
PCRプロセス全体をリアルタイムで監視し、最終的に定量的に分析する信号
未知のテンプレートを標準曲線に通します。
PCR増幅中に、特定の蛍光プローブが同時に添加され、
プライマーのペア。プローブはオリゴヌクレオチドであり、両端はそれぞれ標識されている。
レポーター蛍光基と消光蛍光基を持つ。プローブが
損傷がなければ、レポーター遺伝子から発せられた蛍光シグナルは
消光蛍光基。PCR増幅中、5'-3'エキソヌクレアーゼ活性
Taq酵素はプローブを切断して分解し、レポーター蛍光基を
消光蛍光基から分離され、蛍光モニタリング
システムは蛍光信号を受信できる、つまり蛍光分子が
DNA鎖が増幅されるたびに、完全な同期が達成される。
蛍光信号の蓄積とPCRの形成との間の
製品。
5 主な機器と試薬
5.1 主な装備
リアルタイム蛍光PCR装置、製氷機、核酸タンパク質分析装置またはUV
分光光度計、恒温水槽、遠心分離機、乳鉢、粉砕機
デバイス、ボルテックスシェーカー、マイクロピペット（2.5 μL、20 μL、200 μL、1000 μL）。
5.2 主な試薬
別途指定がない限り、すべての試験で使用される試薬のグレードは分析用であるものとする。
DNAやDNaseを含まない純粋または生化学試薬。使用される水は
試験では、GB / T 6682のグレード1の水の仕様を満たす必要があります。すべての試薬は
DNase に汚染された容器に包装される。
5.2.1 CTAB抽出物：20 g/L CTAB、1.4 mol/L NaCL、0.1 mol/LトリスHCL、0.02 mol/L
Na2-EDTA、pH 8.0。
5.2.2 CTAB沈殿溶液：5g/L CTAB、40mmol/L NaCl。
5.2.3 プロテイナーゼK溶液：20mg/mL。
5.2.4 RNase A: 100 mg/mL。
5.2.5 NaCl 溶液: 1.2 mol/L。
飼料にはさまざまな種類があり、その成分は非常に複雑です。
様々な植物成分、タンパク質ミールなどの様々なプレミックスも含まれている場合があります。
骨粉、アミノ酸、ビタミン、抗生物質（または獣医薬）、ミネラル、抗真菌剤
防虫剤、着色料、調味料、結合剤、発酵製品。これらは
飼料サンプル中の塩分、糖分、色素、その他の化学物質は、
その後のゲノムDNAの抽出を阻害し、その後のPCR反応を阻害する可能性もあります。
など。洗浄などの方法で除去してください。粉砕した200mgを摂取してください。
飼料サンプルを2mLの遠心管に入れ、再蒸留水1.5mLを加えます。
逆さまにしてボルテックスで混ぜ、12000gで5分間遠心分離し、
上清; 沈殿物に再蒸留水1.5mLを加え、上記を繰り返す
洗浄工程を3～5回繰り返し、最終沈殿物をゲノム抽出に使用します。
DNA。
8.2 DNA抽出
8.2.1 CTAB法
CTAB抽出方法は次のとおりです。
a) CTAB抽出緩衝液1000μLとプロテイナーゼK溶液2μLを
上記の200 mgの前処理済みサンプルを65℃で60分間インキュベートし、
この間に3～5回混ぜる。または65℃で一晩インキュベートする。遠心分離機で
12000 gで10分間遠心分離し、上清を別の2 mL遠心分離機に移す。
チューブ。
b) 上清と同量のクロロホルムを加え、転倒混和します。
12000 gで10分間遠心分離し、上清を別の2 mLに移す。