SN/T 2641-2010 英語 PDF (SNT2641-2010)

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SN/T 2641-2010: 食品中の病原体の検出 - PCR-DHPLC法
シリアル番号 2641-2010
ICS65.020.30
B40
業界標準
中華人民共和国
SN/T 2641–2010
食品中の病原体の検出—
PCR-DHPLC法
発行日: 2010年11月1日
2011年5月1日に実施
発行者。
品質監督検査総局
中華人民共和国の検疫
目次
序文…1
1 範囲...1
2 規範的参照 ... 1
3 略語 ... 2
4 バイオセキュリティ対策 ... 2
5 廃棄物処理及び公害防止のための措置…2
6つの原則...2
7 試薬および材料 ... 3
8 主な機器と設備 ... 4
9 方法の概要と検出手順 ... 4
9.1 方法の要約 ... 4
9.2 検査プロセス ... 4
10 操作手順 ... 6
10.1 サンプルの準備、濃縮培養および分離...6
10.2 テンプレートDNAの調製...6
10.3 PCR増幅...6
10.4 DHPLC検出...7
10.5 品質管理のコントラスト設定 ... 8
11 結果と決意…8
11.1 品質管理基準...8
11.2 結果の判定と報告 ... 8
付録A（規範）PCR-DHPLCで使用されるプライマーの配列
食品中の一般的な病原体の検出...9
付録B（参考）規格一覧 ... 11
付録C（参考）DHPLCによる病原体の検出マップの例
食べ物...13
参考文献と中国語原文 ... 14
序文
この規格は、GB/T 1.1-2009 に規定された規則に従って作成されています。
この規格は、認証および認定管理局の管轄下にあります。
中華人民共和国。
責任ある起草機関は遼寧省出入境検査検疫所である。
中国福建省出入国検査検疫局、
中国江西省出入国検査検疫局、吉林省出入国検査検疫局
中国国家検査検疫局と北京英九思科技
開発株式会社
この規格の主な起草スタッフには、Cao Jijuan、Zheng Qiuyue、Xu Junyi、
ホアン・シャオロン、ゲン・リーメイ、スン・ゼピン、ワン・シュウ、ユー・チャン、シャオ・ビイン、ジェン
ジン、楊春華、王振国、高暁波。
食品中の病原体の検出—
PCR-DHPLC法
1 範囲
この規格はサルモネラ菌及びその他30種類の細菌の検出方法を規定している。
食品中の病原体-PCR-DHPLC法。
この規格はサルモネラ菌およびその他30種類の病原菌の迅速検出に適用される。
食べ物に。
注: 一般的な病原菌には、サルモネラ菌、赤痢菌、黄色ブドウ球菌、エルシニア菌など 30 種類あります。
腸炎菌、リステリア菌、カンピロバクター・ジェジュニ、好熱菌、
腸管出血性大腸菌O157.H7、腸管毒素原性大腸菌、腸管病原性
大腸菌、腸管侵襲性大腸菌、エンテロバクター・サカザキ、腸炎ビブリオ、
コレラ菌、ビブリオ・バルニフィカス、ビブリオ・アルギノリティカス、ビブリオ・ミミカス、ビブリオ・フルビアリス、ビブリオ・メチニコビ、
エロモナス ハイドロフィラ、ボツリヌス菌、ウェルシュ菌、セレウス菌、溶血性
連鎖球菌、ブルセラ菌、乳酸菌、緑膿菌、肺炎桿菌、バチルス
プロテウス・ブルガリス、プロテウス・ミラビリス。
2 規範的参照
以下の文書に含まれる記事は、
ここに引用されている日付付き文書については、すべての変更（すべての変更を含む）は、
これに適用されるのは、
標準。
GB/T 6682 分析実験室用水 - 仕様と試験方法
GB 19489 実験室 - バイオセーフティに関する一般要求事項
GB/T 27403 実験室の品質管理基準 - 分子生物学的試験
食べ物
10 操作手順
10.1 サンプルの準備、濃縮培養および分離
関連する国の規制に従って、濃縮培養と分離培養を実施する。
附属書Bに記載されている標準、業界標準、または国際的に権威のある標準方法。
10.2 テンプレートDNAの調製
10.2.1 増菌培養液テンプレートDNAの調製
10.1で培養した対応する病原菌増菌培養液1.5mLを取る（二次培養の場合）
培養が必要な場合は、二次培養液を取り、1.5mLの滅菌
遠心管、13,000g-1分間遠心分離し、上清を捨て、
沈殿物を取り、567μLのTE溶液（pH8.0）を加え、懸濁し、30μLの10％SDSを加える。
3μLのプロテアーゼK（20mg/mL）を加え、均一に混ぜ、37℃の温浴で1時間放置し、100μLを加える。
塩化ナトリウム（5mol/L）を均一に混ぜ、80μLのCTAB/NaCl溶液（10% CTABおよび
0.7mol/L NaCl）、65℃の温浴で10分間均一に混合し、等量の
クロロホルム/イソアミルアルコール（体積比24.1）を均一に混ぜ、
13,000gで10分間遠心分離し、上清を採取し、等量の
フェノール/トリクロロメタン/イソアミロール（体積比25.24.1）を均一に混ぜ、
13,000gで10分間遠心分離し、上清を採取し、0.6倍量の
イソプロパノールを加え、均一に混ぜ、13,000gで10分間遠心分離し、沈殿物を取り除き、
70%エチルアルコールで2回洗浄し、乾燥させ、100μLのTE溶液（pH8.0）を加え、
溶解 - これはDNA溶液です。すぐに検出できない場合は、-20℃で保存してください。
予備用。陽性対照細菌の増菌培養液テンプレートDNAを準備する
同じ方法で、菌株と陰性対照菌株を試験する。市販の菌株も使用できる。
DNA 抽出キットを使用し、指示に従ってテンプレート DNA を準備します。
10.2.2 疑わしい細菌コロニーテンプレートDNAの調製
10.1で分離した疑わしい細菌コロニーまたは葉状体、または1.5mLの
その継代栄養溶液、10.2.1の手順に従ってDNAテンプレートを準備する
検出。市販のDNA抽出キットを使用してテンプレートDNAを準備することもできます。
指示に従ってください。
10.3 PCR増幅
10.4.1、検出手順を設定して実行します。
10.5 品質管理のコントラスト設定
検出プロセスでは、正のコントラストと負のコントラストを設定する必要があります。
それぞれ陽性対照は標的病原体の標準株であり、
ネガティブコントラストは非標的病原体の標準株です。
11 結果と決意
11.1 品質管理基準。
11.1.1 ネガティブコントラスト。吸収ピークは現れません。
11.1.2 陽性コントラストPCR産物の典型的な吸収ピークが現れ、
ピーク吸収値は3mV以上です。
11.1.3 上記のコントラスト品質管理基準を満たさない可能性があるものについては、
無効とみなされます。
11.2 結果の判定と報告
サルモネラ菌の例では、DHPLC 検出パターンの例については付録 C を参照してください。
a) 検出されたサンプルに増幅吸収ピークがない場合、結果は
陰性と判定され、XXX病原体が検出できないことを直接報告する。
b) PCR産物の典型的な吸収ピークが検出されたサンプルに現れ、
吸収ピークが3mVを超える場合、サンプルXXX病原体は次のように判定できる。
疑わしい陽性;
c) PCR産物の典型的な吸収ピークが検出されたサンプルで見られるが、
吸収ピークが3mV未満の場合は、増幅パラメータを調整することを提案する
PCRを再検出します。再検出結果の吸収ピークが3mV未満である場合は、
XXX病原体は陰性である。そうでない場合は、XXX病原体が疑わしいと判断される。
ポジティブ;
d) XXX 病原体の疑わしい陽性結果については、さらに...