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SN/T 2641-2010: 식품 중 병원균 검출 - PCR-DHPLC 방법
일련번호 2641-2010
ICS 65.020.30
비 40
산업 표준
중화인민공화국의
일련번호 2641–2010
식품에서 병원균 검출 -
PCR-DHPLC 방법
발행일 2010년 11월 1일
구현일 2011년 5월 1일
발행처.
품질감독검사총국
중화인민공화국의 검역
목차
서문 ... 1
1 범위 ... 1
2 규범적 참조 ... 1
3 약어 ... 2
4 생물안전 대책 ... 2
5 폐기물 처리 및 오염 방지 대책 ... 2
6가지 원칙... 2
7 시약 및 재료 ... 3
8 주요 계측기 및 장비 ... 4
9 방법 요약 및 탐지 절차 ... 4
9.1 방법 요약 ... 4
9.2 검사 프로세스 ... 4
10 작동 단계 ... 6
10.1 시료 준비, 농축 배양 및 분리 ... 6
10.2 템플릿 DNA의 준비 ... 6
10.3 PCR 증폭 ... 6
10.4 DHPLC 검출 ... 7
10.5 품질관리의 대비 설정 ... 8
11 결과 및 결정 ... 8
11.1 품질관리기준...8
11.2 결과 결정 및 보고 ... 8
부록 A (규범) PCR-DHPLC에 사용되는 프라이머 시퀀스
식품에서 흔히 발견되는 병원균 검출 ... 9
부록 B (정보) 표준 목록 ... 11
부록 C (정보) 병원균의 DHPLC 검출 맵의 예
음식 ... 13
참고문헌 및 원본 중국어 문서 ... 14
머리말
본 표준은 GB/T 1.1-2009에 명시된 규칙에 따라 작성되었습니다.
본 표준은 인증 및 인정 관리국의 관할 하에 있습니다.
중화인민공화국.
책임 초안 작성 기관은 랴오닝 출입국 검사 및 검역입니다.
중국 인민 공화국 국, 중국 인민 공화국 복건성 출입국 검사 및 검역국,
중국 인민 공화국 장시 출입국 검사 및 검역국, 지린 출입국
중국 인민 공화국 검사 및 검역국 및 베이징 영지우시 기술
개발 주식회사
본 표준의 주요 초안 작성 직원으로는 Cao Jijuan, Zheng Qiuyue, Xu Junyi,
황샤오롱, Geng Limei, Sun Zheping, Wang Xu, Yu Chang, Shao Biying, Zheng
징, 양춘화, 왕진궈, 가오샤오보.
식품에서 병원균 검출 -
PCR-DHPLC 방법
1 범위
본 규격은 살모넬라균 및 기타 30여종의 미생물의 검출방법을 규정하고 있다.
식품 중의 병원균 검출-PCR-DHPLC법.
본 규격은 살모넬라균 및 기타 30여종의 병원균의 신속한 검출에 적용한다.
음식에.
참고. 일반적인 병원균 30종에는 살모넬라균, 쉬겔라균, 황색포도상구균, 예르시니아균이 포함됩니다.
엔테로콜리티카, 리스테리아 모노사이토게네스, 캄필로박터 제주니, 굽힘 호열성 박테리아,
장출혈성 대장균 O157.H7, 장독소원성 대장균, 장내병원성
대장균, 장내 침습성 대장균, 엔테로박터 사카자키, 비브리오 파라헤몰리티쿠스,
비브리오 콜레라, 비브리오 벌니피쿠스, 비브리오 알기놀리티쿠스, 비브리오 미미쿠스, 비브리오 플루비알리스, 비브리오 메츠니코비,
에로모나스 하이드로필라, 클로스트리디움 보툴리눔, 클로스트리디움 퍼프린젠스, 바실러스 세레우스, 용혈성
연쇄상구균, 브루셀라균, 유산균, 녹농균, 클렙시엘라 폐렴균, 간균
프로테우스 불가리스, 프로테우스 미라빌리스.
2 규범적 참조
다음 문서에 포함된 항목은 다음과 같은 경우 이 표준이 됩니다.
여기에 인용되어 있습니다. 인용된 날짜가 있는 문서의 경우 모든 수정 사항(모든 수정 사항 포함)은 다음과 같습니다.
이에 따라 이루어진 해당 수정 또는 개정 사항은 이에 적용됩니다.
기준.
GB/T 6682 분석 실험실용 물 - 사양 및 테스트 방법
GB 19489 실험실 - 생물안전에 대한 일반 요구 사항
GB/T 27403 실험실 품질 관리 기준 - 분자생물학적 테스트
음식
10가지 작동 단계
10.1 시료 준비, 농축 배양 및 분리
관련 국가 지침에 따라 농축 및 분리 문화를 실시합니다.
부록 B에 표준, 산업 표준 또는 국제 권위 표준 방법이 나와 있습니다.
10.2 템플릿 DNA의 준비
10.2.1 농축액 템플릿 DNA의 준비
10.1에서 배양한 해당 병원균 농축액 1.5mL을 취합니다(2차 배양액의 경우)
배양이 필요한 경우 2차 농축 배지를 취하고 1.5mL 멸균 배지에 넣습니다.
원심분리관, 13,000g-1분간 원심분리; 상층액은 버리고
침전물을 채취하여 TE 용액(pH8.0) 567μL를 첨가하고, 현탁시키고 10% SDS 30μL를 첨가합니다.
및 3μL 단백질 분해효소 K(20mg/mL)를 넣고 균일하게 혼합한 후 37℃ WARM-BATH에서 1시간 동안 방치하고 100μL를 첨가합니다.
염화나트륨(5mol/L)을 균일하게 혼합하고 80μL CTAB/NaCl 용액(10% CTAB 및
0.7mol/L NaCl)을 균일하게 혼합하고 65℃ 10분간 온수욕을 한 후 동일한 양의 NaCl을 첨가합니다.
클로로포름/이소아밀알코올(부피비 24.1)을 균일하게 혼합한다.
13,000g-10분간 원심분리; 상층액을 취하고 동일한 양의
페놀/트리클로로메탄/이소아밀올(부피비 25.24.1)을 균일하게 혼합합니다.
13,000g-10분간 원심분리한다; 상층액을 취하고, 0.6배의 양을 첨가한다.
이소프로판올, 균일하게 혼합, 13,000g-10분간 원심분리; 침전물 채취,
70% 에틸 알코올로 2회 세척하고 건조시킨 후 TE 용액(pH8.0) 100μL를 첨가합니다.
용해 -- 이것은 DNA 용액입니다. 즉시 감지할 수 없는 경우 -20℃에서 보관하십시오.
여분으로 사용하기 위해 양성 대조군 박테리아의 농축 배지 템플릿 DNA를 준비합니다.
균주와 음성 대조 세균 균주를 같은 방식으로 사용할 수도 있습니다. 상업용도 사용할 수 있습니다.
DNA 추출 키트를 사용하고 지침에 따라 템플릿 DNA를 준비합니다.
10.2.2 의심 세균 콜로니 템플릿 DNA 준비
10.1mL 또는 1.5mL의 분리에서 얻은 의심스러운 세균 군집 또는 탈루스를 선택합니다.
그 통과 영양소 용액, 10.2.1의 단계에 따라 DNA 템플릿을 준비하십시오.
감지. 또한 상업용 DNA 추출 키트를 사용하고 템플릿 DNA를 준비할 수도 있습니다.
지시에 따라.
10.3 PCR 증폭
10.4.1, 감지 절차를 설정하고 실행합니다.
10.5 품질관리의 대비 설정
검출 과정에서 양의 대비와 음의 대비가 설정되어야 합니다.
각각 양성 대조는 표적 병원균의 표준 균주와
음성 대조는 비대상 병원균의 표준 균주입니다.
11 결과 및 결정
11.1 품질관리기준.
11.1.1 부정적 대비. 흡수 피크가 나타나지 않음.
11.1.2 양성 대조. PCR 생성물의 전형적인 흡수 피크가 나타나고,
최대 흡수 값은 3mV보다 큽니다.
11.1.3 위의 대조 품질 관리 기준을 충족하지 못할 수 있는 경우에는
무효로 간주됨.
11.2 결과 결정 및 보고
살모넬라균의 경우, DHPLC 검출 패턴의 예는 부록 C를 참조합니다.
a) 검출된 샘플에 증폭 흡수 피크가 없는 경우 결과는 다음과 같습니다.
음성으로 판정되었으며 XXX 병원균을 검출할 수 없다고 직접 보고합니다.
b) 검출된 샘플에 PCR 생성물의 전형적인 흡수 피크가 나타나는 경우
흡수 피크가 3mV 이상인 경우 샘플 XXX 병원균은 다음과 같이 결정될 수 있습니다.
의심스러운 양성;
c) 검출된 샘플에서 PCR 생성물의 전형적인 흡수 피크가 나타나지만
흡수 피크가 3mV 미만인 경우 증폭 매개변수를 조정하는 것이 좋습니다.
PCR을 통해 재검출합니다. 재실행 결과의 흡수 피크가 여전히 3mV 미만인 경우
XXX 병원균은 음성입니다. 그렇지 않으면 XXX 병원균을 의심스러운 것으로 판단할 수 있습니다.
긍정적인;
d) XXX 병원균에 대한 의심스러운 양성 결과에 대해서는 추가로...