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YY/T 1561-2017 : Produits médicaux issus de l'ingénierie tissulaire - Détermination de l'antigène α-Gal résiduel dans les matériaux d'échafaudage utilisant des tissus animaux et leurs dérivés
AA/T 1561-2017
NORME DE L'INDUSTRIE PHARMACEUTIQUE
DE LA RÉPUBLIQUE POPULAIRE DE CHINE
ICS 11.040.40
C 45
Dispositifs médicaux issus de l'ingénierie tissulaire - Remnant α-Gal
détermination d'antigènes dans les matériaux d'échafaudage utilisant des animaux
tissus et leurs dérivés
PUBLIÉ LE : 28 MARS 2017
Mis en œuvre le : 01 avril 2018
Publié par : l'Administration nationale des aliments et des médicaments
Table des matières
Avant-propos ... 3
Présentation ... 4
1 Portée ... 5
2 Références normatives ... 5
3 Termes et définitions... 5
4 Réactifs et instruments ... 5
5 Procédures de test ... 7
6 Calcul de la teneur en antigènes ... 9
7 Critères d'acceptation des tests ... 11
8 Rapport d'essai ... 11
Références ... 12
Dispositifs médicaux issus de l'ingénierie tissulaire - Remnant α-Gal
détermination d'antigènes dans les matériaux d'échafaudage utilisant des animaux
tissus et leurs dérivés
1 Portée
Cette norme fournit une méthode de détermination quantitative de l'antigène α-Gal résiduel
dans les matériaux biologiques utilisant des tissus animaux et leurs dérivés utilisés dans la
préparation de matériaux d'échafaudage pour produits de dispositifs médicaux d'ingénierie tissulaire.
La présente norme s'applique à la détermination de l'antigène α-Gal dans divers matériaux biologiques.
utilisant des tissus animaux et leurs dérivés utilisés pour la préparation d'échafaudages
matériaux pour produits médicaux d'ingénierie tissulaire.
2 Références normatives
Les documents référencés suivants sont indispensables à l'application de cette
document. Pour les références datées, seule l'édition citée s'applique. Pour les références non datées,
la dernière édition du document référencé (y compris les éventuelles modifications) s'applique.
GB/T 16886.20, Évaluation biologique des dispositifs médicaux - Partie 20 : Principes et
méthodes de test d'immunotoxicologie des dispositifs médicaux (GB/T 16886.20-2015,
(ISO/T S10993-20:2006, IDT)
YY/T 0606.25, Produit médical issu de l'ingénierie tissulaire - Partie 25 : Quantification de
ADN résiduel dans les matériaux biologiques utilisant des tissus animaux et leurs dérivés :
Méthode de fluorescence
3 Termes et définitions
Les termes et définitions déterminés par GB/T 16886.20 et YY/T 0606.25 sont applicables
à ce document.
4 Réactifs et instruments
4.1 Réactifs
Les réactifs comprennent :
a) tampon phosphate salin (PBS, pH 7,4) ;
5 Procédures de test
5.1 Préparation des échantillons
5.1.1 Échantillon d'essai
Pesez avec précision l'échantillon d'essai (2 mg ~ 10 mg) et placez-le dans un récipient de 2,0 ml ou 5 ml.
tube à centrifuger stérile. S'il s'agit d'un échantillon de test en bloc ou en feuille solide, utilisez un tube ophtalmique stérile
ciseaux pour couper l'échantillon en petits morceaux ; pour un échantillon d'essai liquide ou en poudre, pas de particularité
un traitement est nécessaire. Ajoutez la solution de lyse (qui peut être une solution disponible dans le commerce
produit) pour préparer l'échantillon à une concentration de 2 mg/mL ~ 10 mg/mL [ajouter 1 % (volume
fraction) 1 mmol/L PMSF avant utilisation, ce qui, pour la commodité de l'opération, est
[il est recommandé d'utiliser 2 ml de solution de lyse pour chaque échantillon] ; homogénéiser l'échantillon à
basse température pendant 2 min ~ 10 min, jusqu'à ce que tous les échantillons soient écrasés pour former un mélange uniforme
homogénat de tissu ; placer à température ambiante (25 °C ± 5 °C) pendant 30 min ~ 3 h jusqu'à ce que le
l'échantillon est complètement lysé (c'est-à-dire qu'aucune matière solide évidente n'est observée à l'état nu
œil) ; centrifuger (à 3 000 r/min ~ 5 000 r/min) et récupérer le surnageant pour une utilisation ultérieure.
Remarque 1 : Pour chaque échantillon, définissez trois échantillons parallèles et prenez la moyenne ± ET comme valeur finale.
résultat de la détermination.
Remarque 2 : Selon les exigences de la partie mandataire, prélever 3 échantillons de
numéros de lot différents ou le même numéro de lot pour évaluer le processus
stabilité de différents lots ou d'un même lot.
5.1.2 Échantillons de courbes standard
Peser avec précision 2 mg de matériel biologique de référence négatif à l'antigène Gal
(poudre lyophilisée) échantillon ; placez-le dans un tube à centrifuger stérile de 2 ml ou 5 ml ; ajoutez le
solution de lyse [ajouter 1 % (fraction volumique) 1 mmol/L PMSF avant utilisation] pour préparer un
concentration d'échantillon de 2 mg/mL, contenant Gal α 1-3gal-BSA. Placer à température ambiante
température (25 °C ± 5 °C) pendant 30 min ~ 3 h jusqu'à ce que tous les échantillons soient lysés ; centrifugeuse (à
3 000 r/min ~ 5 000 r/min) ; puis, prélever le surnageant ; utiliser la solution de lyse pour multi-
dilution par gradient de concentration, pour obtenir au moins 5 dilutions en série de Gal α 1-3gal-
BSA, qui sont utilisés pour réaliser la courbe standard. Afin d'obtenir le minimum
concentration détectable de chaque test, il doit être dilué à une concentration dont
la valeur OD de détection est égale ou similaire à la valeur OD de détection de l'antigène Gal
référence négative, afin de déterminer sa concentration antérieure comme minimum
concentration détectable de ce test.
Remarque : Il est conseillé de déterminer la plage de concentration de Gal α 1-3gal-BSA par
pré-expérience en fonction de la teneur en antigène Gal dans l'échantillon à tester,
afin de garantir que la valeur de détection OD de l'échantillon à tester se situe dans
la plage de la courbe standard.
5.1.3 Échantillons de référence positifs et négatifs à l'antigène Gal
Pesez avec précision 2 mg de substances de référence positives et négatives pour l'antigène Gal
(poudre lyophilisée), respectivement ; placez-les dans les tubes à centrifuger stériles de 2 mL ou 5 mL ;
ajouter la solution de lyse pour préparer 2 mg/mL [ajouter 1 % (fraction volumique) 1 mmol/L PMSF
[avant utilisation] ; placer à température ambiante (25 °C ± 5 °C) pendant 30 min ~ 3 h jusqu'à ce que les échantillons
sont complètement lysés ; centrifuger les échantillons lysés et récupérer le surnageant pour une utilisation ultérieure.
5.1.4 Échantillons de puits de contrôle
Lot de 1 échantillon de solution de lyse de référence de matériel biologique négatif à l'antigène M86/Gal
échantillon de réaction comme valeur de réaction à 100 % et 1 échantillon de la réaction de la solution de lyse
échantillon comme valeur d'arrière-plan.
5.2 Incubation de l'anticorps M86
Prenez 200 μL de chaque échantillon en 5.1 et placez-les dans les tubes à centrifuger de 1 mL ; étiquetez
eux; ajouter un volume égal (200 μL) de solution d'anticorps M86 avec un rapport de dilution de
1:100 ~ 1:200 pour chaque tube (il faut s'assurer que l'anticorps M86 est en excès, ce qui
peut être confirmé par des expériences préliminaires). Après mélange, laisser réagir pendant 2 h à température ambiante
température (25 °C + 5 °C) avec agitation douce (par exemple, 100 tr/min) ; puis, incuber à 4 °C
pendant la nuit. Le lendemain, recueillir le surnageant après centrifugation à 14 000 g et 4 °C
pendant 30 min.
Remarque : Étant donné que M86 est un anticorps non purifié, il peut y avoir des différences d'activité
entre les lots. Il est recommandé de confirmer si l'activité de l'anticorps est
différent du lot précédent avant d'utiliser le nouveau réactif et revérifiez le
rationalité du rapport de dilution des anticorps si nécessaire.
5.3 Détermination de l'anticorps M86 résiduel dans le surnageant par inhibition ELISA
méthode
5.3.1 Préparation de plaques revêtues d'antigènes en phase solide
Tout d'abord, utilisez de l'eau déionisée pour diluer Gal α 1-3gal-BSA (par exemple, 500 μg/mL Gal-BSA) par un
un certain nombre de fois (par exemple, 25 fois) ; ensuite, utilisez un tampon carbonate de pH 9,5 pour diluer
à nouveau (par exemple, 10 fois), pour préparer une solution de dilution de 2 μg/mL de Galα1-3gal-BSA.
100 μL/puits ; ajouter à la plaque de microtitration ; bien mélanger et agiter doucement à température ambiante
température pendant 2 heures ; puis, incuber à 4 °C pendant une nuit pour le revêtement. Le lendemain, utiliser
la liqueur de lavage (0,05% Tween-20/PBS) pour laver la plaque au moins 3 fois (avec un chiffon doux
agitation, 100 tr/min) ; sécher sur du papier absorbant. Ajouter 200 μL/puits de 1 % (masse)
(concentration) d'albumine sérique pour scellage ; placer à 37 °C pendant 2 h en agitant doucement.
Ensuite, lavez et séchez à nouveau.
Remarque 1 : La plaque revêtue de Galα1-3gal-BSA préparée une fois peut être scellée et stockée à
4 °C et à utiliser dans la semaine.
a) Remplacez le taux d'inhibition de la liaison M86 de l'échantillon d'essai par ...