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GB 15193.28-2020: 食品安全国家基準 - 哺乳類細胞微小核のin vitro試験
GB 15193.28-2020
イギリス
国家標準の
中華人民共和国
国家食品安全基準 -
哺乳類細胞微小核の試験管内試験
発行日: 2020年9月11日
実施日: 2021年3月11日
発行元：中華人民共和国国家衛生健康委員会
国家市場監督管理総局。
目次
1 範囲 ... 3
2 用語と定義 ... 3
3 テストの目的と原理 ... 4
4 器具と試薬 ... 4
5 試験方法 ... 7
6 データ処理と結果判定 ... 12
7 テストレポート ... 12
8 テストの解釈 ... 13
国家食品安全基準 -
哺乳類細胞微小核の試験管内試験
1 範囲
この規格は、以下の試験の基本的な試験方法と技術的要件を規定する。
試験管内における哺乳類細胞の微小核。
この規格は、試験物質の遺伝毒性効果を評価するために適用されます。
2 用語と定義
2.1 小核
染色体が定期的に娘細胞に入り、核を形成すると、
有糸分裂後期、染色分体全体または無動原体断片またはリング
細胞質内に残る染色体。最終段階では、1つまたは複数の規則的な
亜核は別々に形成され、細胞の細胞質に含まれます。
2.2 セントロメア
細胞分裂中、染色体が紡錘糸と結合する領域
娘染色体が娘細胞の2つの極に移動することを可能にする
秩序あるやり方。
2.3 異数性
1つ以上の完全な染色体が欠落しているか、または追加された変異型。
二倍体染色体補体。
2.4 異数性変異原
細胞の有糸分裂または減数分裂周期に作用して異常な細胞分裂を引き起こす物質
分裂し異数性を誘発します。
2.5 染色体切断
染色体腕には、その長さが染色体腕の幅よりも大きいギャップがある。
染色体腕。
2.6 染色体異常誘発物質
最小、滅菌または濾過します。
4.3.1.3 補酵素II（酸化型）溶液
無菌状態でコエンザイムIIを計量し、滅菌蒸留水で溶解する
0.025 mol/L 溶液を調製し、使用直前に調製します。
4.3.1.4 グルコース-6-リン酸ナトリウム塩溶液
グルコース-6-リン酸ナトリウム塩を量り、蒸留水で溶かして調製する。
0.05 mol/L溶液に溶解し、濾過滅菌する。直前に調製する。
使用。
4.3.2 ラット肝臓S9成分の誘導と調製
体重150g～200gの健康な雄成体SDまたはWistarラットを選択し、
5週齢～6週齢。トウモロコシにポリ塩化ビフェニル（アロクロール1254）を溶解する
200g/Lの濃度の油を無菌的に腹腔内注射する。
500mg/kgの重量で投与し、5日後に動物を殺処分し、
犠牲の前に12時間断食した。
フェノバルビタールナトリウムの複合誘導法によっても調製できる。
およびβ-ナフトフラボン。ラットにフェノバルビタールナトリウムとβ-ナフトフラボンを投与し、
経口投与。投与量はいずれも80mg/kg体重で3日間投与。16時間絶食後、
動物は首を切られて犠牲にされる。その他の作業は
ポリ塩化ビフェニル誘導。
動物を殺した後、肝臓を取り出します。肝臓の重量を量った後、
新鮮な氷冷0.15 mol/L塩化カリウム溶液で数回洗浄し、
ミクロソーム酵素の活性を阻害する可能性のあるヘモグロビンを除去するためです。
肝臓1グラム（湿重量）あたり0.1mol/L塩化カリウム溶液3mLを加える。
ビーカーと一緒に氷水に移します。肝臓を滅菌ハサミで切り、
ガラスホモジナイザー（4000 r/min以下、1分～2分）または組織に入れて
ホモジナイザー（20000 r/min以下、1分）で肝臓ホモジネートを作製する。
操作では無菌性と局所的な低温環境に注意する必要があります。
調製した肝臓ホモゲネートを低温（0℃～4℃）の高速遠心分離機で遠心分離する。
9000gで10分間遠心分離し、上清をS9成分として吸引し、
滅菌したクライオチューブに、チューブあたり約2mLずつ分配します。液体窒素または
ドライアイスで急速凍結し、-80℃の低温で保存します。
S9成分を調製した後、タンパク質含有量（ローリー法）を測定する。
無菌検査で決定され、1mLあたりのタンパク質含有量は以下を超えてはならない。
40mg; 間接変異原性物質の生物学的活性は適格であり、
-80℃の低温で保存するか、冷凍乾燥し、保存期間が
1年。
c) 最初の溶液50mLを取り、2番目の溶液50mLに加え、混ぜる。
ウェルは、pH 6.8 の 1/15 mol/L リン酸緩衝液です。
5つのテスト方法
5.1 試験物質
固体試験物質は適切な溶媒に溶解し、
適切な濃度で液体試験物質をそのまま使用することも、希釈して使用することもできます。
使用に適した濃度で試験物質を調製する。試験物質は無菌的に調製する。
使用直前に保管してください。それ以外の場合は、保管中に
安定性に影響します。
5.2 セル
チャイニーズハムスター肺細胞株（V79、CHL）または卵巣細胞株（CHO）、マウス
リンパ腫細胞株（L5178Y）、ヒト末梢血リンパ球株（TK6など）
一次培養細胞を選択することができます。CHLまたは
L5178Y細胞株。細胞は染色体数の安定性と
使用前にマイコプラズマ汚染を確認してください。
5.3 テストスキームの選択
この試験は、cytoBを使用するものと使用しないものの2つの方式に分かれています。方式1：
細胞を試験物質で処理し、有糸分裂前にcytoBを使用し、その後観察する
完了した細胞（二核細胞）の微小核率を分析する
1 回の有糸分裂。ヒトリンパ球を使用する場合は、Scheme-1 を使用することをお勧めします。
細胞の起源が異なれば、その周期も異なるため、すべての細胞が反応するわけではない。
フィトヘマグルチニン（PHA）。スキーム2：cytoBを使用せず、観察し、
細胞を試験で処理した後、細胞の微小核率を分析する
試験物質が活性を阻害することを示す証拠がある場合
cytoBの、またはcytoBが細胞の成長に影響を与える可能性がある（マウスリンパ腫細胞株など）、
その場合は、スキーム 2 を採用することをお勧めします。
5.4 投与量
5.4.1 投与量設定
少なくとも3つの検出用量を設定する。試験物質が細胞毒性を示さない場合は、
最高用量から少なくとも2用量。一般的に、間隔係数は
2～3である。細胞毒性がある場合、用量範囲は55％±5％をカバーするものとする。
細胞毒性はほとんどない状態まで変化しました。
5.4.2 最高用量の選択
使用した溶剤が安全でないことを証明できる文献や過去のデータがない場合
変異原性がある場合は、ブランクコントロールを設定する必要があります。
5.5 テスト手順
5.5.1 セルの準備
培養皿（ボトル）に一定数の細胞を接種します。細胞を採取する際には、
培養皿（ボトル）内の細胞が増殖していない場合は、
標準。接着細胞は一般に約 85% まで増殖することが望ましいです。
5.5.2 試験物質の処理
5.5.2.1 適用スキーム1: 培養液を吸引し、細胞を洗浄する
リン酸緩衝液。無血清培養液と一定濃度の
試験物質（代謝活性化が必要な場合は、S9ミックスも同時に添加する）
培養器に3時間～6時間置き、培養終了後、培養液を吸引する。
テスト サブを含む...