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GB 15193.4-2014: 국가 식품 안전 표준 -- 세균 복귀 돌연변이 시험
GB 15193.4-2014
영국
국가 표준
중화인민공화국
국가식품안전기준 - 세균복귀돌연변이
시험
발행일: 2014년 12월 24일
구현일: 2015년 5월 1일
발행처: 인민보건가족계획위원회
중화민국
목차
서문 ... 3
1 범위 ... 4
2 용어 및 정의 ... 4
3 시험 목적 및 원리 ... 4
4 기구 및 시약 ... 5
5 세균 균주 및 그 동정 및 보존 ... 10
6 실험 설계 및 시험 물질 처리 ... 13
7 시험방법 ... 15
8 데이터 처리 및 결과 평가 ... 16
9 보고서 ... 17
10 시험 해석 ... 18
부록 A 돌연변이 유전자, 시험 유형, 생물학적 특성 및 자발적
시험 균주의 역전 ... 19
부록 B 표준 진단 돌연변이원 ... 21
부록 C OECD 및 USEPA가 권장하는 양성 돌연변이원 ... 23
국가 식품 안전 표준 -
세균 역전 돌연변이 검사
1 범위
세균 역돌연변이 검사에는 살모넬라 티피무리움 역돌연변이가 포함됩니다.
테스트 및 Escherichia coli 역전 돌연변이 테스트. 이 표준은 기본을 지정합니다.
살모넬라 티피무리움 역전 돌연변이 검사에 대한 기술적 요구 사항.
대장균을 세균 복귀 돌연변이 시험을 위해 선택하려면 관련 문헌이 필요합니다.
언급되다.
본 표준은 시험물질의 돌연변이 효과 평가에 적용됩니다.
2 용어 및 정의
2.1 세균 역전 돌연변이 시험
영양요구성 돌연변이 균주를 사용하여 유전자 돌연변이를 검출하기 위한 시험관 내 테스트
지표 생물. 일반적으로 사용되는 균주에는 히스티딘 영양 요구균주인 살모넬라균이 포함됩니다.
티피무리움(typhimurium)과 트립토판 영양요구균인 대장균(Escherichia coli).
2.2 염기대체 유전자 돌연변이
DNA 폴리뉴클레오타이드 사슬의 특정 염기가 다른 염기로 대체되어
DNA 염기 서열의 이상.
2.3 프레임시프트 유전자 돌연변이
1개 또는 여러 개의 염기(3 및 3의 배수 제외)가 삽입되거나 삭제되는 경우
DNA 염기서열은 삼중코드의 연속적인 판독 규칙에 따라 모두
이 부위 이후의 코돈 구성이 변화되고, 폴리펩타이드 사슬은
합성 가이드도 완전히 바뀔 것입니다.
3 테스트 목적 및 원리
시험물질이 미생물(박테리아)에 미치는 유전적 돌연변이 효과를 검출
유전독성과 잠재적인 발암 효과를 예측합니다.
세균복귀 돌연변이 검사는 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)과 대장균(Escherichia coli)을 사용합니다.
하나 또는 그 이상의 교체, 삽입 또는 삭제를 포함하는 점 돌연변이를 감지하려면
부록 A에 표시된 것처럼 여러 염기쌍의 DNA. 살모넬라균의 테스트 균주
typhimurium과 Escherichia coli는 히스티딘 결핍 돌연변이체이고 트립토판
80℃, 플레이트당 25mL의 비율로 플레이트를 준비합니다(90mm 플레이트 기준). 그 후
응축 및 응고를 위해 37℃ 인큐베이터에 플레이트를 뒤집어서 넣어주세요.
사용 가능 시간은 24시간입니다.
4.2.3.2 인산염 스톡 용액(Vogel-Bonner 최소배지 E, 50배)
인산수소암모늄나트륨(NaNH4HPO4·4H2O) 17.5g
구연산(C6H8O7·H2O) 10.0g
인산수소칼륨(K2HPO4) 50.0g
황산마그네슘(MgSO4·7H2O) 1.0g
100mL에 증류수를 더하여 녹인 후, 0.103MPa에서 20분간 살균합니다.
참고사항: 다른 시약이 완전히 용해된 후 마그네슘을 천천히 넣어주세요.
계속 용해시키기 위해 황산염을 첨가해야 합니다. 그렇지 않으면 쉽게 침전이 생깁니다.
4.2.3.3 40% 포도당 용액
포도당 40.0g에 증류수를 가하여 100mL로 만들고 0.055MPa에서 20분간 살균한다.
분.
4.2.3.4 1.5% 아가배지
400 mL 원뿔 플라스크에 아가가루 6.0 g을 넣고, 400 mL에 증류수를 첨가한다.
용융 후 0.103MPa에서 20분간 살균합니다.
4.2.4 상부배지
상부 아가를 녹이기 위해 가열한 후, 히스티딘-비오틴 용액(0.5mmol/L) 10mL을 모든 아가에 첨가합니다.
100 mL의 탑 아가. 잘 섞는다. 4개의 플라스크에 나눈다. 0.103 MPa에서 20분간 살균한다.
녹여서 작은 시험관에 2ml씩 나누어 담는다. 45℃ 수조에서 따뜻하게 보관한다.
다음과 같이 상부 아가와 히스티딘-비오틴 용액(0.5 mmol/L)을 준비합니다.
4.2.4.1 상부 아가
3.0g의 아가가루에 증류수를 더하고 2.5g의 염화나트륨을 더하여 500mL로 만든다.
0.103MPa에서 20분간 살균합니다.
4.2.4.2 히스티딘-비오틴 용액(0.5mmol/L)(돌연변이 시험용)
D-비오틴 30.5mg에 증류수 250ml를 첨가합니다(상대 분자량 244)
및 19.4mg의 L-히스티딘(상대 분자량 155)을 함유하고 0.103MPa에서 20분간 살균합니다.
최소
4.2.5 특수시약 및 배양배지
4.2.5.1 0.8% 암피실린 용액(균주 식별용, 무균적으로 제조)
수산화나트륨 용액(0.02 mol/L)을 사용하여 암피실린 40 mg을 5 mL로 희석합니다.
나중에 사용하기 위해 4°C 냉장고에 보관하세요.
4.2.5.2 0.1% 크리스탈 바이올렛 용액(균주 식별용)
크리스탈 바이올렛 100mg을 멸균수에 녹여 100mL로 만든다.
4.2.5.3 L-히스티딘 용액 및 D-비오틴 용액(0.5mmol/L) (균주 식별용)
각각 0.404 3 g의 L-히스티딘과 12.2 mg의 D-비오틴을 증류수에 녹인다.
100 mL까지; 0.103 MPa에서 20분간 살균; 나중에 사용하기 위해 4 °C 냉장고에 보관하세요.
4.2.5.4 0.8% 테트라사이클린 용액(테트라사이클린 내성 시험 및 암피실린-
테트라사이클린 플레이트)
염산 완충액(0.02 mol/L)을 사용하여 테트라사이클린 40 mg을 5 mL로 희석하여 보관합니다.
4°C 냉장고에 보관하세요.
4.2.5.5 암피실린 플레이트(TA97, TA98 및 TA100 균주의 마스터 플레이트로 사용)
및 암피실린-테트라사이클린 플레이트(TA102 균주의 마스터 플레이트로 사용)
각 1,000mL에는 다음 성분이 포함되어 있습니다:
바닥배지 980ml
히스티딘 수용액(0.404 3 g/100 mL) 10 mL
비오틴(0.5mmol/L) 6mL
0.8% 암피실린 용액 3.15 mL
0.8% 테트라사이클린 용액 0.25 mL
테트라사이클린은 테트라사이클린 내성 TA102를 사용할 때만 첨가합니다. 각 성분
개별적으로 살균되었거나 무균적으로 준비되었습니다.
4.2.5.6 히스티딘-비오틴 플레이트(테스트에는 히스티딘을 사용해야 함)
각 1,000mL에는 다음 성분이 포함되어 있습니다:
바닥배지 984mL
히스티딘 수용액(0.404 3 g/100 mL) 10 mL
비오틴(0.5mmol/L) 6mL
각 재료는 개별적으로 살균되었습니다.
3일 연속으로 금식 없이 80mg/kg의 용량으로 경구 투여합니다.
동물의 목을 베어 16시간 금식 후. 다른 작업은 PCB와 동일합니다.
유도.
동물을 죽인 후 간을 제거하고 무게를 달고 신선한 간으로 계속 씻어냅니다.
얼음처럼 차가운 염화칼륨 용액(0.15 mol/L)을 여러 번 통과시켜 헤모글로빈을 제거한다.
미세소체 효소 활동을 억제합니다. 염화칼륨 용액 3mL(0.1
간 1g당 mol/L)을 측정합니다(습중량); 비이커와 함께 간을 얼음 욕조로 옮깁니다.
멸균 가위를 사용하여 간을 조각으로 자릅니다. 유리 균질화기(4 미만)에 넣습니다.
000 r/min, 1분 ~ 2분) 또는 조직 균질화기(20,000 r/min 미만, 1분)로
간을 균질화합니다. 위의 작업은 무균 및 국소에 대한 주의가 필요합니다.
추운 환경.
준비된 간 균질물을 저온(0℃ ~ 4℃) 고온에서 원심분리한다.
9,000g에서 10분간 속도 원심분리합니다. 상층액을 S9로 흡인합니다.
성분을 추출하여 멸균된 냉동 튜브나 앰플에 분배합니다. 각 앰플은
약 2ml. 액체질소나 드라이아이스에서 급속 냉동한 후 80°C에서 보관합니다.
S9 구성 요소가 준비되면 멸균 검사를 받고 측정합니다.
단백질 합성...